Después de este primer período dedicado casi en exclusiva a los recursos cinegéticos, comienza una segunda época (hacia el siglo XVIII), en la que se consolidan tres usos: la explotación forestal del bosque, el mantenimiento de las dehesas y pastos para la ganadería, y el fomento del coto como cazadero, para lo que se acondiciona de nuevo el antiguo palacio.

El interés científico y naturalista arranca en el siglo XIX, con la publicación de un catálogo de aves observadas en algunas provincias de Andalucía, realizado por Don Antonio Machado y Núñez. Es también el comienzo de una intensa búsqueda de huevos y pieles por parte de naturalistas y cazadores, lo que llega a poner en grave peligro las poblaciones de algunas especies.

En el siglo XX los nuevos propietarios de Doñana introducen especies animales, plantan pinos piñoneros y organizan monterías de forma habitual. Pocos años después, en 1940, se constituye la Sociedad Cinegética del Coto del Palacio de Doñana.

La inmensa riqueza faunística de estas tierras atrae también a ornitólogos de todo el mundo, que proponen en 1952 la internacionalización de su propiedad.

Es el comienzo de una conciencia conservacionista dentro y fuera de nuestras fronteras, que culmina en 1963 con la adquisición de unas 7.000 ha por parte del Estado Español, en colaboración con el Fondo Mundial para la Conservación de la Naturaleza (WWF) y la creación de la Reserva Biológica de Doñana.

Seis años después se crea el Parque Nacional de Doñana, que será ampliado y reclasificado por su Ley de Régimen Jurídico en 1978 y que posteriormente ha ampliado sus límites en 2004. Desde entonces, diversas figuras de protección internacional confluyen en este territorio.